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- 국내산라이츄
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예, 그렇습니다. 힘세고 강한 일요일입니다.
1. blue white screening이란?
일단 유전자를 클로닝하기 위해서는 어떤 유전자를 PCR로 불리고, 그걸 벡터(빈 벡터)에 접합하고(ligation), 그걸 형질전환 세포에 넣어서(transformation) 불려줘야 합니다. 아니 근데 이걸 균이 뭐 카톡하는것도 아닌데 잘 들어갔는지는 어떻게 아냐 이거죠. 여기서 '잘 들어갔는가'의 기준은
1) 벡터가 무사히 형질전환 균주 안으로 들어갔고 형질전환 균주가 무사히 살아남았는가? (형질전환 세포 유리몸입니다)
2) 그래서 그 접합은 잘 된거임?
이 두가지입니다. 전자의 경우 벡터에 특정 항생제 저항 유전자가 들어있어서 벡터가 잘 들어갔다면 그 항생제가 들어간 배지에서도 균이 살아남습니다.
이 벡터를 보면 뭔 괴랄한 영어가 있는데 왼쪽에 amp가 보이시나요? 저건 항생제 중 하나인 앰피실린의 약어입니다. 벡터 지도에서 항생제 풀네임을 쓰는 것은 넘모 바이트 낭비였던것... 그래서 벡터에 있는 항생제 저항 관련 유전자에는 저런 약어가 들어갑니다. 아무튼... 그래서 저게 뭔 뜻이냐면 이 벡터가 들어간 박테리아는 앰피실린에 저항성을 갖는다 이 말입니다. 즉, 벡터가 제대로 들어갔다면 앰피실린이 있는 배지에서 균이 살아남습니다. 그럼 그 벡터에 균이 제대로 들어갔는지 보려면 어떻게 하나요? 일일이 피쌸 돌려요? 그 콜로니 개많아서 그건 힘들고요... 이럴 때 필요한게 바로 블루 화이트 스크리닝입니다. 저 벡터도 블루 화이트 스크리닝 전용 벡터예요.
2. 어떻게 하나요?
자세한 프로토콜은
https://www.sigmaaldrich.com/KR/ko/technical-documents/technical-article/genomics/cloning-and-expression/blue-white-screening
여기에 설명되어있습니다. 근데 솔직히 얘네는 주로 연구원들을 타겟으로 하기 때문에 일반인이 이해하기에는 좀 어려워요... 위에도 잠깐 나왔지만 접합-형질전환-스크리닝인데 그럼 이 스크리닝을 어떻게 하는지 대충 알아봅시다.
DNA를 접합하고 형질전환까지 마친 균을 배양해야 하는데, 일단 배양할 한천 배지가 미리 준비되어 있어야 합니다. 한천 배지에 IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)와 X-gal(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside, a.k.a BCIG)을 도말해주고(삼각 스프레드로 쳐발쳐발해줍니다) 균을 도말해주고 하루 지나면(대장균 기준입니다)
짜자잔! 냄새는 맡지 마십쇼. 똥방구 냄새 납니다.
저기서 흰색 콜로니만 픽해서 배양하면 특정 DNA가 접합된 벡터를 가지고 있는 균주의 확보가 가능해집니다. 이제 저거 불려서 벡터 뽑아서 지지고 볶으시면 됩니다.
3. 원리가 뭐길래?
아니 근데 접합하고 형질전환하고 화합물 깔고 배지에서 키웠는데 이게 어떻게 픽이 되죠?
이런 원리로요.
예, 그럴 수 있죠...
위의 pUC19 벡터 지도를 보면 amp 오른쪽에 뭔가 있는 것을 보실 수 있습니다. 예, LacZ 뭐시기요. 저건 lacZ 오페론이라는건데, 저기서 β-galactosidase라는 효소를 만드는겁니다. 저 효소의 기질이 X-gal이고, 저걸 컷해서 최종적으로 파란색을 만들게 됩니다. 그럼 왜 파란색이 아니라 하얀색을 고르는건가요?
이건 좀 더 자세한 pUC19의 벡터 지도입니다. 보시면 수상하게 막대기가 몰려있는 곳이 있을건데, 보통 그 부분을 제한효소로 절단하고 DNA를 접합하게 됩니다. 예를 들자면 BamHI이라는 제한효소로 자르고 거기다가 PCR로 불린 DNA를 접합하게 되는건데, 이 경우 DNA가 제대로 끼어들어갔다면 효소가 만들어질 수가 없기 때문에 X-gal을 대사할 수 없어서 흰 콜로니가 됩니다.
저게 없었다면... 피쌸만 몇번이여 어유...
